前言

抗體類藥物的研發(fā)日益增多，為了確保這些分子質(zhì)量屬性的準(zhǔn)確描述，需要采用復(fù)雜的技術(shù)手段。質(zhì)譜（MS）由于其優(yōu)于目前現(xiàn)有分析技術(shù)的結(jié)構(gòu)分辨能力，已經(jīng)成為治療性抗體研發(fā)的幾乎必備的分析工具。質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于抗體研發(fā)的各個階段，包括克隆選擇、細(xì)胞培養(yǎng)過程開發(fā)、純化過程開發(fā)、制劑開發(fā)、穩(wěn)定性研究和可比性研究。質(zhì)譜確定的結(jié)構(gòu)特征包括氨基酸序列、二硫鍵位置、碳水化合物結(jié)構(gòu)和特征以及許多不同的翻譯后、過程中和貯存中的修飾。

在本綜述中，我們將討論用于單克隆抗體（mAbs）結(jié)構(gòu)表征的各種基于質(zhì)譜的技術(shù)。在討論mAbs結(jié)構(gòu)表征策略之前，有必要定義本文中使用的一些術(shù)語。通過質(zhì)譜表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變異或修飾時，完整分子的質(zhì)量測量可以呈現(xiàn)出整個蛋白質(zhì)的一般特征，但不能提供變異或修飾的位置。換句話說，完整分子的質(zhì)量測量并不能提供任何結(jié)構(gòu)分辨信息。為了獲得結(jié)構(gòu)分辨的信息，需要在進(jìn)行質(zhì)量分析之前將蛋白質(zhì)切割成較小的片段。這種切割過程可以在溶液中或氣相中進(jìn)行。當(dāng)片段主要在溶液中生成時，質(zhì)譜儀用于分析每個片段，分子根據(jù)從這些片段獲得的信息構(gòu)建：我們稱這種方法為“up”類型方法。另一方面，當(dāng)片段主要在質(zhì)譜儀內(nèi)的氣相中生成時，質(zhì)譜儀用于直接分析整個分子，我們稱這種方法為“down”類型方法。

“up”和“down”方法進(jìn)一步分為“bottom-up”、“middle-up”、“top-down”和“middle-down”方法亞型。方法亞型取決于引入質(zhì)譜儀的分子大小相對于完整分子的大小。當(dāng)直接將感興趣的完整分子引入質(zhì)譜儀時，該方法是“top-down”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被切割成幾個大片段時，如果直接測定這些片段的質(zhì)量，則該方法是“middle-up”的方法；如果在質(zhì)譜儀內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的片段化，則為“中間向下”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被消化成小肽時，該方法是“middle-down”的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在引入質(zhì)譜儀之前被消化成小肽時，該方法稱為“bottom-up”方法，無論這些肽是否進(jìn)行MS/MS。這些技術(shù)在結(jié)構(gòu)分辨率、序列覆蓋率、樣品消耗和分析便利性方面各有優(yōu)缺點。將這些方法應(yīng)用于mAbs結(jié)構(gòu)表征的總結(jié)如圖1所示，將在以下章節(jié)中詳細(xì)討論。

(相關(guān)資料圖)

圖1: 不同的基于質(zhì)譜的技術(shù)用于單克隆抗體的結(jié)構(gòu)表征

02基本概念

2.1儀器分辨率

質(zhì)量測量的質(zhì)量取決于質(zhì)譜儀的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性。高分辨率的儀器可以分辨質(zhì)量稍有不同的分子，使它們的質(zhì)量能夠分別確定，而不是作為加權(quán)平均值合在一起。所有天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)都具有普遍的質(zhì)量異質(zhì)性，這來自不同分子的不同同位素組成以及復(fù)雜發(fā)翻譯后修飾。如果質(zhì)譜儀具有足夠的分辨率，那么這些同位素峰可以分辨，每個個體同位素組成的質(zhì)量可以確定。在這些同位素峰中，單一同位素峰是最重要的，因為它是唯一具有獨特同位素組成的峰。然而，對于如mAb這樣的大型蛋白質(zhì)，單一同位素峰是不可觀察的，同位素分布如此廣泛，以至于難以確定每個同位素峰中包含多少重穩(wěn)定同位素。因此，同位素峰的精確質(zhì)量用途有限。此外，對于像mAb這樣大的蛋白質(zhì)，同位素峰很難分辨。由于儀器分辨率與儀器靈敏度之間通常存在折衷，因此評估質(zhì)量測定完整mAb的最佳分辨率是有幫助的。圖2顯示了一個典型的mAb（元素組成為C6600H10172N1738O2103S52）的模擬同位素分布作為分辨率（R=M/DM）的函數(shù)。可以看出，當(dāng)分辨率在8000以上時，同位素包絡(luò)峰寬度沒有顯著改變。盡管當(dāng)分辨率達(dá)到200000時，同位素峰開始分辨，但它們的精確質(zhì)量提供的信息很少，而且在這種高分辨率下，靈敏度會受到影響。因此，最佳分辨率約為8000-10000。分辨率在10000以上通常不會有助于分辨任何mAb異質(zhì)性。在自然峰寬（半高處）達(dá)到25 Da的情況下，很難分辨出質(zhì)量變化較小的異質(zhì)性，如氧化（+16 Da），而用任何儀器幾乎不可能分辨出脫酰胺（+1 Da

圖2：典型單克隆抗體元素組成為C6600H10172N1738O2103S52，不同分辨率（R=M/ΔM）的模擬同位素分布。

2.2 質(zhì)量準(zhǔn)確度在一個分子的許多同位素峰中，單一同位素峰是唯一具有單一同位素組成的峰，因此具有唯一確定的理論質(zhì)量。因此，在評估較小分子質(zhì)量測定的準(zhǔn)確性時，通常只使用單一同位素峰。然而，對于像mAb這樣的大分子，同位素峰極難分辨。即使同位素峰被分辨出來，由于單一同位素峰的豐度幾乎為零，無法可靠地確定單一同位素質(zhì)量。因此，必須使用抗體的平均質(zhì)量來確認(rèn)其元素組成。事實上分子的平均質(zhì)量受到組成該分子的元素的同位素豐度的影響。例如，在重組mAb的生產(chǎn)過程中，哺乳動物（CHO）細(xì)胞被喂養(yǎng)20種氨基酸和一些其他營養(yǎng)物質(zhì)，這將確定產(chǎn)出抗體中的同位素豐度。因為不同元素的同位素豐度主要取決于它們的來源，因此，應(yīng)該使用不同來源的元素的原子量來計算不同來源化合物的平均質(zhì)量。表1顯示了蛋白質(zhì)中元素的IUPAC標(biāo)準(zhǔn)原子量和范圍。表1中還顯示了根據(jù)有機物中這些元素的同位素豐度估計的原子量及其范圍。在計算天然蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量時，最好使用有機來源元素的原子量，因為它們是這些分子中元素的主要來源。例如，對于元素組成為C6600H10172N1738O2103S52的mAb，其理論質(zhì)量根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)原子量計算為149181.15 Da。但是，當(dāng)使用根據(jù)有機來源估計的原子量時，計算出的理論質(zhì)量為149181.89 Da。這個差異（0.74 Da）相當(dāng)于mAb的理論平均質(zhì)量差異為5.0 ppm。由于大自然中同位素豐度的變化，蛋白質(zhì)的平均質(zhì)量很容易因為幾ppm而發(fā)生變化。例如，碳的原子量變化0.00008 Da（C3代謝過程的陸生植物范圍的一半）會導(dǎo)致相同的mAb分子質(zhì)量差異為0.53 Da（3.5 ppm）。類似地，其他元素的變化也會導(dǎo)致分子平均質(zhì)量的低ppm差異（氫為1.6 ppm，氮為1.7 ppm，氧為1.3 ppm，硫為1.0 ppm）。總體而言，由于天然同位素豐度的變化，mAb的平均質(zhì)量變化范圍在3-5 ppm左右，前提是使用表1右列的有機來源元素的平均原子量。表1：常見原子不同來源的質(zhì)量數(shù)

因此，測量mAb質(zhì)量的關(guān)鍵因素包括儀器分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確性。對于大型蛋白質(zhì)如mAb，最佳分辨率約為8000-10000，分辨率在10000以上通常不會有助于分辨任何mAb異質(zhì)性。質(zhì)量準(zhǔn)確度對于識別不同修飾和異質(zhì)性也至關(guān)重要。理想情況下，蛋白質(zhì)質(zhì)量的測定應(yīng)具有足夠高的準(zhǔn)確性，接近于天然同位素豐度變化所致的平均質(zhì)量變化，從而有助于準(zhǔn)確評估蛋白質(zhì)的組成和可能的修飾.

近年來，飛行時間質(zhì)譜（TOF）已在質(zhì)量準(zhǔn)確性（2-10 ppm）、分辨率（5,000-20,000）和最大m/z（高達(dá)10,000）方面取得了顯著成果。當(dāng)分析儀配備ESI時，這些特點非常適合測定完整mAbs的質(zhì)量。

早期嘗試使用ESI-TOF進(jìn)行完整mAb質(zhì)量分析的研究受到了當(dāng)時儀器性能的限制。隨著ESI和TOF技術(shù)的不斷改進(jìn)，ESI-TOF和ESI-Q-TOF已被廣泛認(rèn)為是分析大分子蛋白質(zhì)（如mAbs）質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)儀器。

在ESI-TOF儀器上，使用每日外部校準(zhǔn)，測定完整mAbs質(zhì)量的質(zhì)量準(zhǔn)確性通常低于100 ppm。通過仔細(xì)執(zhí)行實驗，可以將完整mAb的質(zhì)量準(zhǔn)確性測定為25-50 ppm。在實驗條件下優(yōu)化以減少加合物形成，實驗前進(jìn)行校準(zhǔn)，并嚴(yán)格控制去卷積參數(shù)，部分實驗室可以實現(xiàn)接近10 ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確性。

TOF通常可提供的最高分辨率比Orbitrap 和FTICR MS 低幾倍，盡管最近的多通道TOF 分析儀能夠?qū)崿F(xiàn)超高分辨率（在m/z 400 處，R≥100000）。同時，TOF的分辨率在MS 和MS/MS 模式下基本相同，這在形式上是對Orbitrap 分析儀的一個優(yōu)勢，因為Orbitrap 在MS/MS 模式下常常為了速度而犧牲分辨率。然而，在實際應(yīng)用中，TOF在MS/MS 模式下的較高分辨率并不一定能夠轉(zhuǎn)化為更高的質(zhì)量精度（這通常是最理想的分析參數(shù)），因為TOF 的傳輸效率受到限制。因此，與TOF 相比，在類似的實驗中，Orbitrap質(zhì)譜儀實際報告的真正陽性識別率可能更高。

峰值檢測限由信號/噪聲比確定，由于檢測器的暗電流、漂移離子以及“化學(xué)”背景離子的存在，TOF的噪聲會增加。這些非共價的復(fù)合物由分析物離子、溶劑和有時還有氣態(tài)分子組成，其電荷通常來自于質(zhì)子以外的堿金屬和其他附加物。這些非共價復(fù)合物在每個m/z單位處產(chǎn)生寬而模糊的峰，其峰谷由類似來源的多帶電離子和其亞穩(wěn)解離產(chǎn)物填充。這種化學(xué)背景的存在通常是限制TOF儀器檢測閾值和動態(tài)范圍的主要因素。有點諷刺的是，使用FT分析器（包括FTICR和Orbitrap）獲得的質(zhì)譜圖幾乎不含有化學(xué)背景。這種現(xiàn)象的可能解釋是，要被檢測到（即使是在錯誤的m/z處），背景離子只需要進(jìn)入TOF分析器，之后就可以由于碰撞而解離或偏離其路徑，而這兩個事件都不會顯著影響檢測概率。同時，在FT質(zhì)譜圖中產(chǎn)生一個尖銳的、軟件識別的峰，需要離子在FT分析器內(nèi)保持完整的、相干的運動狀態(tài)與類似離子共存達(dá)到較長的時間，即多毫秒的時間。所有偏離軌道、亞穩(wěn)的或不相干的離子要么不會被FT檢測到，要么會貢獻(xiàn)于寬闊、平滑的背景信號，這些信號可以很容易地被軟件減去。因此，盡管TOF的靈敏度形式上更高，但FT分析器的真實檢測極限可能是可比或更低的。

Orbitrap Orbitrap質(zhì)譜是近期新增的分析工具之一，由Alexander Makarov發(fā)明。Orbitrap質(zhì)譜儀由一個同心的中央電極和一個桶狀電極組成，并在兩個電極之間施加靜電場。注入靜電場的離子被兩種力約束；靜電場抵消離心力場，并使離子在中心電極上軸向和徑向運動。軸向的諧振頻率應(yīng)用于m/z測量，因為這種振蕩模式與離子能量無關(guān)。外部電極上的圖像電流用于檢測。

質(zhì)量分辨率取決于采集時間（更具體地說是諧振次數(shù)），因此更高的質(zhì)量分辨率需要較長的采集時間，可實現(xiàn)m/z=400處的200,000的質(zhì)量分辨率，這比大多數(shù)TOF儀器高得多(PS:廣告詞而已，m/z=400在抗體分析中并不是一個典型的質(zhì)荷比，分辨率隨著m/z的上升會隨之下降，可以見下圖，單方面強調(diào)廣告級別的分辨率并沒有太大意義。PS的PS: Thermo打錢我就刪，當(dāng)然Orbitrap的性能包括易維護性確實比TOF好)。

Orbitrap與FTICR的分辨率與m/z的關(guān)系（所有數(shù)據(jù)均顯示為0.76秒掃描）

商業(yè)上，Orbitrap質(zhì)譜儀通過C-trap與線性離子阱相耦合。C-trap的作用是在進(jìn)入Orbitrap質(zhì)譜儀的入口處電動擠壓離子以收斂。線性離子阱和Orbitrap質(zhì)譜儀可以分別或組合使用。例如，在分析模式下，Orbitrap可以執(zhí)行質(zhì)量分析，而離子阱用于接口離子源，連續(xù)傳輸離子并定期將離子引入Orbitrap。兩者可以同時操作，其中在Orbitrap中執(zhí)行質(zhì)量分析，而在線性離子阱中執(zhí)行MS/MS或MSn碎片實驗并進(jìn)行質(zhì)量分析。

03結(jié)構(gòu)表征

3.1Middle-UP的結(jié)構(gòu)表征

雖然測定完整mAbs的質(zhì)量可以給出蛋白質(zhì)的整體表示，但它不能提供任何結(jié)構(gòu)分辨率。要獲得結(jié)構(gòu)分辨信息，必須在質(zhì)量分析之前將蛋白質(zhì)切割成更小的片段。另一種方法，稱為“Middle up”方法，包括在質(zhì)譜分析之前將蛋白質(zhì)（mAbs）切割成幾個大片段。將mAb切割成幾個大片段的一種方便方法是還原二硫鍵以生成重鏈和輕鏈。對單個鏈的質(zhì)量分析可用于確認(rèn)每個鏈的結(jié)構(gòu)，或者定位每個單獨鏈中的變體或修飾。

完全還原所有二硫鍵可以在變性條件下進(jìn)行還原。在沒有變性劑的情況下，可以選擇性地還原鏈間二硫鍵，使鏈內(nèi)二硫鍵保持完整。這種簡單的還原方法已被用于確認(rèn)mAb結(jié)構(gòu)，表征抗體結(jié)構(gòu)，確定輕鏈和重鏈上的不同修飾，并檢查重鏈上的糖基化結(jié)構(gòu)。

另一種常見的中間向上方法是在天然條件下用蛋白酶（如木瓜蛋白酶，胃蛋白酶）對mAbs進(jìn)行處理。對于許多IgG類分子，這些有限消化的切割位點通常在鉸鏈區(qū)附近，生成Fab、F(ab)2和Fc片段。然而，IgG2分子在天然條件下抵抗酶解。這些通過酶生成的片段還原后會產(chǎn)生更小的片段。這些片段的質(zhì)量分析提供了比完整mAb質(zhì)量測量更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。與還原方法類似，有限消化方法已被用于確認(rèn)mAb結(jié)構(gòu)，識別翻譯后或化學(xué)修飾，以及表征抗體結(jié)構(gòu)。

與完整的mAbs相比，這些片段要小得多，因此更容易分析，可能在不太理想的儀器上具有更高的質(zhì)量準(zhǔn)確度。例如，對于IgG1分子，重鏈質(zhì)量約為51 kDa，輕鏈23 kDa，F(xiàn)c 53 kDa，單鏈Fc 26 kDa，F(xiàn)ab重鏈（Fd）24 kDa，F(xiàn)ab 48 kDa，F(xiàn)(ab)2 96 kDa，相較之下，完整的IgG1質(zhì)量為150 kDa。由于要分析的分子尺寸顯著減小，而且大多數(shù)片段不受糖基化異質(zhì)性影響，因此減少了質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍和分辨率要求。因此，這些片段可以在大多數(shù)儀器上進(jìn)行分析，如四極桿或離子阱，盡管ESI-TOF/Orbitrap仍然是首選方法。

通過有限消化和/或還原產(chǎn)生的片段通常通過RP-HPLC分離，并與ESI-MS在線分析。例如，將DTT還原或木瓜蛋白酶消化應(yīng)用于IgG1分子，然后進(jìn)行RP-HPLC/MS分析，以表征和定量諸如焦谷氨酸環(huán)化、脫酰胺化、天冬酸異構(gòu)化和氧化等多種修飾。還原或消化后，RP-HPLC上的亞結(jié)構(gòu)分離良好。圖3顯示了木瓜蛋白酶消化后的IgG1進(jìn)行質(zhì)譜分析的總離子色譜圖。圖中還展示了峰5-7的質(zhì)譜峰。從確定的質(zhì)量可以明顯看出，峰5是具有不同糖基的Fc區(qū)域，峰6是氧化的Fc區(qū)域，峰7是具有去酰胺的Fc區(qū)域。峰1-4被確定為Fab區(qū)域的不同形式，包括焦谷氨酸環(huán)化和脫酰胺（未顯示在圖中）。

圖3

Middle up分析提供了一種簡單的方法，將結(jié)構(gòu)變化定位到分子的特定區(qū)域。這種方法具有一定程度的結(jié)構(gòu)分辨率，但無法將變化定位到特定的氨基酸殘基。這種方法對于確定抗體中結(jié)構(gòu)變化的位置非常有用，但對于確定結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在哪個具體氨基酸上，則需要更高分辨率的方法。

3.2 BOTTOM-UP的結(jié)構(gòu)表征

要確認(rèn)蛋白質(zhì)序列或在殘基水平上表征修飾，最常用的技術(shù)是bottom up的方法。在bottom up的方法中，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化成小肽，然后進(jìn)行LC/MS，或更常見的LC/MS/MS分析。蛋白水解與LC/MS/MS分析相結(jié)合，提供了高結(jié)構(gòu)分辨率，但在質(zhì)譜分析中，它通常是最耗材料、耗時且勞動密集的。消化過程中的假陽性，包括易失修飾如琥珀酰亞胺的丟失，以及氨基酸重排，可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)論，因此需謹(jǐn)慎處理。bottom up廣泛用于確認(rèn)蛋白質(zhì)序列，表征翻譯后、過程中和貯存中的修飾，以及表征二硫鍵連接。

A.蛋白水解通常在變性條件下對mAb進(jìn)行還原和烷基化后，使用胰蛋白酶或Lys-C進(jìn)行蛋白水解。其他不太常用的蛋白酶包括Glu-C（V8）和Asp-N?；瘜W(xué)切割方法，如氰酸溴（CNBr）消化，也偶爾會使用。

以上所有方法通常將蛋白質(zhì)切割成適當(dāng)大小的肽，這些肽在MS/MS實驗中能有效地片段。需要注意的是，在大多數(shù)商用儀器上，大肽（>4 kDa）很難通過MS/MS表征，而非常小的肽（2-3個殘基）通常由于在反相柱上的保留不佳而丟失。

B. LC/MS和 LC/MS/MS 在早期，MALDI-TOF儀器廣泛用于測定從mAb和其他蛋白質(zhì)的蛋白水解產(chǎn)生的肽的質(zhì)量，用于結(jié)構(gòu)確認(rèn)和異構(gòu)體/修飾分析。與ESI-MS相比，MALDI-TOF具有易用性，且耗材和時間較少的優(yōu)點。然而，由于LC串聯(lián)的便利性和肽鑒定所需的串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)量較好，目前大多數(shù)在mAb上進(jìn)行的自下而上實驗都是在ESI儀器上進(jìn)行的。

在LC/MS/MS肽圖實驗中，困難通常出現(xiàn)在mAb的蛋白水解上。通常需要大量的蛋白質(zhì)材料才能獲得成功的消化。只要實現(xiàn)完全消化，由于現(xiàn)代儀器的顯著進(jìn)步，MS檢測的靈敏度通常不是問題。因此，大多數(shù)LC/MS/MS肽圖實驗是在小孔徑RP-UPLC柱上進(jìn)行，以獲得最佳的色譜分辨率。

C.二硫鍵確定要確定蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵連接方式，必須在二硫鍵仍然完整的情況下進(jìn)行消化。在普通條件下，單克隆抗體分子非常穩(wěn)定并且難以消化，因此單克隆抗體內(nèi)的二硫鍵連接方式的表征具有挑戰(zhàn)性。成功的消化關(guān)鍵在于在強性變性條件下使單克隆抗體變性，例如6M鹽酸胍和高溫。重要的是，在變性過程中必須存在烷基化試劑，如碘乙酸（IAA），碘乙酰胺（IAM）或N-乙基馬來酰亞胺（NEM），阻止單克隆抗體中所有存在的自由巰基組來防止二硫鍵雜化。由于其在較低pH下的活性，通常優(yōu)先使用NEM。消化前必須稀釋變性劑以保留蛋白酶的活性。消化通常使用胰蛋白酶或Lys-C。隨后，一部分樣品會將使用DTT或者TCEP進(jìn)一步還原二硫鍵，并將LC / MS / MS肽圖與未還原圖進(jìn)行比較以確定二硫鍵連接?？拷q鏈區(qū)域的二硫鍵通常使用Edman測序或者使用TCEP在弱酸性下在NEM or M-biotin存在的條件下部分還原檢測。

另一個用于確定mAb中二硫鍵的有用方法是在負(fù)離子模式下通過LC/MS分析非還原消化物。在負(fù)離子模式下，二硫鍵通常被有效地斷裂，以顯示通過二硫鍵連接的鏈。這種方法可以被視為在氣相中的二硫鍵還原。

治療性抗體的二硫鍵結(jié)構(gòu)通常必須經(jīng)過確認(rèn)，以確?？贵w被正確制備和折疊。大多數(shù)重組的單克隆抗體確實顯示出與預(yù)期結(jié)構(gòu)一致的二硫鍵結(jié)構(gòu)，除了IgG2分子。有證據(jù)表明，重組和自然發(fā)生的IgG2分子中存在二硫鍵的異質(zhì)體。當(dāng)在非還原條件下消化重組的IgG2分子時，觀察到一些后期洗脫的RP-HPLC峰。這些峰的質(zhì)譜分析以及這些峰的收集和還原形式的質(zhì)譜分析表明，它們是二硫鍵連接的肽；所有這些肽都涉及連接到輕鏈恒定區(qū)和/或CH1域的鉸鏈區(qū)。這個結(jié)果表明，在IgG2分子中存在二硫鍵變異體。這些二硫鍵變異體可以通過離子交換和反相色譜分離，并且它們在全血或“血液樣”環(huán)境中相互轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步的研究表明，這些二硫鍵變異形式也存在于人骨髓瘤IgG2和人血清多克隆抗體中。

3.3 TOP-DOWN結(jié)構(gòu)表征

盡管bottom up的方法提供了最多的結(jié)構(gòu)信息，但是它們需要大量的人力，而且常常存在一些問題，比如需要消耗大量樣品，消化過程中可能會引入人為因素，以及樣品制備需要花費很長時間。對于數(shù)量或濃度有限的樣品，例如從色譜分離中獲得的微量組分，需要進(jìn)行多次收集和濃縮才能獲得足夠的材料進(jìn)行成功的酶解。在這種情況下，top-down和middle-down成為提供有用序列信息的非?？焖俸头奖愕倪x擇。

Top-down質(zhì)譜法是指將完整分子引入質(zhì)譜儀，而不進(jìn)行溶液中的酶解或化學(xué)分解，并通過分析分子在質(zhì)譜儀內(nèi)的裂解模式來獲得結(jié)構(gòu)信息。自上而下的質(zhì)譜法可成功地快速表征小到中等大小的蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)生的高度帶電的碎片離子數(shù)量龐大，因此通常需要高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行top-down的質(zhì)譜分析。通常來說，可以通過儀器分辨率來確定可用自上而下質(zhì)譜法分析的蛋白質(zhì)大小。例如，分辨率為10,000的Q-TOF型儀器應(yīng)該可以為重量達(dá)到10,000 Da的蛋白質(zhì)提供大量的結(jié)構(gòu)信息。對于更大的蛋白質(zhì)，首選具有更高分辨率的儀器，如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR MS）或Orbitrap

圖4展示了當(dāng)在Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap上分析IgG2分子時的in-source fragmentation圖譜。除了小的N末端輕鏈碎片和小的N末端和C末端重鏈碎片以及一些內(nèi)部碎片離子外，一個相當(dāng)引人注目的觀察結(jié)果是存在一系列大離子，這些離子的存在表明在重鏈的b106到b118離子和輕鏈的b114到b118離子之間存在一些結(jié)構(gòu)信息。這些N末端碎片對應(yīng)于重鏈和輕鏈的整個可變區(qū)域。可以對這些b離子進(jìn)行MS/MS以獲得有關(guān)可變區(qū)域更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。

圖4：一種IgG2分子in-source fragmentation質(zhì)譜圖。完整的圖譜顯示在頂部。底部顯示了從m/z 1,500到1,850的圖譜。主要的碎片離子用帶電荷的b或y離子標(biāo)記。前綴H代表重鏈，L代表輕鏈。

Top-down的質(zhì)譜法消耗的材料很少，可以在很短的時間內(nèi)提供有用的結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)與在線液相色譜/質(zhì)譜法相結(jié)合時，in-source fragmentation的完整mAb可以在沒有任何樣品制備的情況下提供有用的可變區(qū)域以及末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)信息。

自上而下的質(zhì)譜法用于大蛋白質(zhì)（如mAb）的主要缺點是通常具有有限的結(jié)構(gòu)分辨率。對于IgG1和IgG2分子，只能獲得可變區(qū)域和末端附近的信息。在大多數(shù)情況下，機緣巧合仍然是決定實驗結(jié)果的重要因素。如果感興趣的修飾位點位于富含序列信息的區(qū)域，則可以準(zhǔn)確地確定修飾位點。在其他情況下，如果修飾位點位于序列信息較少的區(qū)域，則可以將修飾位點分配給蛋白質(zhì)的一個較大的片段，但無法指定特定的氨基酸殘基。

3.4 MIDDLE-DOWN結(jié)構(gòu)表征

Middle down可能是解決自top down中結(jié)構(gòu)分辨率有限問題的一種有價值的替代方法。在middle down中，蛋白質(zhì)首先通過還原二硫鍵或者有限的蛋白酶水解作為中間步驟分成幾個大片段，然后再被引入質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS分析。與top down相比，middle down可以在一些有限的樣品制備情況下潛在地提高結(jié)構(gòu)分辨率。由于中等質(zhì)量實驗中所采用的還原二硫鍵是化學(xué)反應(yīng)，可以使用大量的化學(xué)試劑來實現(xiàn)，因此它不像酶反應(yīng)那樣有樣品濃度的要求，因為酶反應(yīng)通常不使用大量的酶（貴貴貴貴?。?。因此，對于稀釋的少量樣品，middle down實驗比top down更有優(yōu)勢。

圖5顯示了一種IgG2分子的輕鏈和重鏈的CID MS/MS譜圖，該譜圖是在Thermo LTQ-Orbitrap上獲得的。Orbitrap的超高分辨率和質(zhì)量精度可確保片段離子的準(zhǔn)確鑒定。通過MassAnalyzer的分配和手動驗證，根據(jù)準(zhǔn)確測定的質(zhì)量、同位素模式和一些片段化規(guī)則，大多數(shù)片段離子可以分配為b、y或其他片段。根據(jù)這些分配，輕鏈中213個肽鍵中有59個被切割，重鏈中447個肽鍵中有67個被切割；這些數(shù)據(jù)對應(yīng)于輕鏈的平均結(jié)構(gòu)分辨率（通過將肽鍵的總數(shù)除以被切割的肽鍵數(shù)來計算兩個切割位點之間的平均殘基數(shù)）為3.6個殘基，重鏈為6.7個殘基。

圖5

04未來展望直到最近，幾乎所有的mAb結(jié)構(gòu)表征都是通過bottom-up方法實現(xiàn)的。雖然bottom-up方法越來越成熟，但是top-down和middle-down方法仍處于發(fā)展初期。然而，top-down/middle-down方法的優(yōu)點，如最小樣品操作和快速反應(yīng)時間，使得這些技術(shù)非常有吸引力。雖然并不是所有的結(jié)構(gòu)問題都能用top-down或middle-down方法解決，但許多問題可以在幾個小時內(nèi)解決，而不是像"up"方法一樣需要幾天時間。top-down/middle-down方法沒有被廣泛接受的主要原因之一是它們需要高分辨率的儀器。然而，現(xiàn)代高分辨率儀器，如FT-ICR和Orbitrap，正在變得更加用戶友好，并且這些高端儀器正逐漸放到工業(yè)MS用戶手中。 當(dāng)表征蛋白質(zhì)異構(gòu)體或修飾時，"bottom-up"方法將逐漸成為輔助方法，只有在"top-down"或"middle-down"實驗失敗時才會使用。電子俘獲解離（ECD）在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的"up"和"down"方法中具有巨大潛力。然而，由于使用難度大，需要FT-ICR儀器，因此它并沒有成為蛋白質(zhì)化學(xué)家的主要工具。然而，最近開發(fā)的電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于離子阱儀器中。此外，在Orbitrap上實現(xiàn)ETD使得對更大的肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析成為可能，并且對于middle-down實驗來說成為了理想的選擇。

參考文獻(xiàn)：Roman A. Zubarev and Alexander Makarov.Orbitrap Mass Spectrometry. doi.org/10.1021/ac4001223

Zhongqi Zhang, Hai Pan, and Xiaoyu Chen. Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies. DOI 10.1002/mas.20190